伊拉斯謨精通希臘語和拉丁語，因此他可以將《希臘語經卷》（俗稱「新約」）的早期手抄本，與《通俗拉丁文本聖經》等幾個拉丁語譯本作對比。他越來越意識到聖經的知識對人極為重要，所以他堅信聖經應該被翻譯成當日各國通用的語言。

伊拉斯謨相信基督教信仰應該是一種生活方式，而不該只是墨守毫無意義的宗教儀式而已，因此他積極推動天主教會的內部革新。後來，一些改革家開始抗議並要求羅馬天主教會進行改革。那時，伊拉斯謨由於自己之前的立場而遭到天主教會的猜忌。

伊拉斯謨在自己的著作裡，以諷刺的口吻揭露教士階層墮落的行為和奢華無度的生活方式，他甚至指責教皇支持戰爭、野心勃勃。伊拉斯謨與當日腐敗的教士截然不同，那些教士利用教會的傳統——如聖人崇拜、懺悔認罪、朝拜、禁食——來剝削信徒。對教會的一些做法，如出售贖罪券、禁止神職人員結婚，伊拉斯謨也不認同。

1516年，伊拉斯謨編訂的希臘語《新約》聖經第一版問世了。這是首部印刷的《新約》希臘語文本，書中還包括他翻譯的拉丁語《新約》和所作的注解。不過，伊拉斯謨的翻譯和當時最權威的《通俗拉丁文本聖經》已有所區別。後來，伊拉斯謨繼續修訂自己的譯本，最終二者的區別就更大了。

其中一個區別是約翰一書5:7。為了支持三位一體的教義，《通俗拉丁文本聖經》在此加插了原文沒有的話，這節「杜撰的經文」說：「在天上有父，有道，有聖靈，這三位是合一的。」但伊拉斯謨發現，沒有任何早期希臘語手抄本包含這句話。因此，他在編訂希臘語《新約》的頭兩版時，都沒有收錄這節「杜撰的經文」，後來迫於教會的壓力，他才在第三版中添加了這句話。

伊拉斯謨編訂的希臘語《新約》聖經，為歐洲其他語言的聖經翻譯奠定了基礎。德國的馬丁·路德、英國的廷德爾、意大利的布魯喬奧利和西班牙的恩西納斯，都根據伊拉斯謨的希臘語文本，將《新約》翻譯成各自的母語。

伊拉斯謨生活的時代正值歐洲宗教界風起雲湧之時，他編訂的希臘語《新約》聖經被宗教改革家視為無價之寶。在很長一段時間裡，他都被視為宗教改革家。不過，後來天主教會和宗教改革家進行激烈的神學辯論時，伊拉斯謨卻拒絕支持任何一方。因此，學者戴維·沙夫曾這樣評價伊拉斯謨：「他去世時無門無派、遺世獨立；天主教不願承認他，而基督新教也無法接納他。」